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수능현자 [94898] · MS 2018 (수정됨) · 쪽지

2020-08-31 12:38:44
조회수 11,069

한약재 성분 알아보자 (3) 황금, 단삼

게시글 주소: https://ui.orbi.kr/00031893262

(5.5M) [1188]

한약재의 생리활성성분 분리 및 효능유전자 확인연구-황금, 단삼.pdf

의사와 한의사, 의대생과 한의대생의 대립이 심화되고 있다.


그 중에 한약은 깜장물이 아니냐 뭐가 들어있는지도 모르는데 어디다 써먹냐는 등


여러 폄훼를 조금이나마 해소해 보고자 글을 쓰고 있다.



다행히 2편까지 반응이 좋아 글을 쓰고자 하는 힘이 난다.


누군가 이제와서 하냐고 하는데 


이거 국책사업으로 이미 다 종료된 것들이다. 2005년 경에 많은 과제가 이루어졌고


2011년까지 3단계에 걸쳐서 많은 한약재가 국책사업으로 연구가 되었다.



또 in vitro 수준이니까 의미없는 거 아니냐고 하지만


지금 코로나 약도 다 그렇게 출발하는 거다 


대규모 임상시험까지는 단순히 근거만 필요한게 아니고 시간과 돈이 필요하다.


한약의 경우 각 국가 약전에 맞추어 연구를 진행하기 때문에


당연히 우리나라의 경우 예산도 병원도 부족한 상황에서 진행이 더딜 수 밖에 없다.



서론은 이만큼 하고 오늘은 황금과 단삼이다.


역시 식약처에서 용역을 주어 진행된 연구로 2005, 2006년에 걸쳐 안동대학교에서 진행되었다.


243페이지에 해당하는 원문을 첨부하였으니 읽어보기를 추천함.


그래도 예의상 간략하게 총괄 연구과제 요약만 정리해 봄.



총괄 연구과제 요약 - 한약재 생리활성 성분 분리 및 효능 유전자 확인 연구 (황금, 단삼)


연구내용


황금과 단삼을 추출 및 분획하고 이들을 각각 크로마토그라피를 실시하여 

황금으로 부터 19종의 화합물, 단삼으로부터 11종의 화합물을 분리하였다. 

각각을 분광학적 수단을 사용하여 구조결정한 결과 황금은 17종의 flavonoids 화합물과 

phenolic 화합물인 guaiacol과 paeonol 2종임을 확인하였고 

단삼은 diterpenoid 5종과 lignin 6종임을 확인하였으며 생리활성검색의 시료로 제공하였다. 

황금과 단삼에 함유된 생리활성물질들의 동시정량법을 HPLC/UV 법과 LC-MS/MS 법으로 

각각 새로이 개발하였다. 동시정량법에 대한 validation을 실시함으로써 

동시분석법에 대한 타당성을 입증하였다. 

황금과 단삼의 시중 유통품에 대해 활성성분의 함량을 측정하였다. 

또한 한약재 및 각 약재별 유효 성분을 제시하고 각각의 효능을 제시하고자 

DNA microarray를 이용하였다. 한약재추출물 또는 성분을 처리 후 약 3만개의 유전자 중 

발현 변화를 나타내는 효능 유전자를 발굴하고 자 청열약으로 분류되는 

황금과 활혈거어약으로 분류되는 단삼 및 그 성분들을 LPS 처리한 대식세포에 처리하여 

항염 효과 및 항산화 효능을 검색하였다. 

황금의 항염 효능 성분으로는 baicalein, wogonin, chrysin을 제시하였고, 

단삼의 항산화 효능 성분으로 tanshinone I, cryptotanshinone, rosmarinic acid, 

salvianolic acid B을 제시하였다. 

DNA microarray 분석결과 inflammation, apoptosis, anti-oxidant 등과 관련된 

pathway 관련 유전자들의 발현 변화가 가장 크게 나타났으며 

선정한 효능 유전자들에 대해서 RT-PCR을 이용한 검증결과 IL-11 R α1, IL-6 ST, Tgfb1 등의 

유전자를 효능 유전자로 제시하였다.



연구성과


한약재에 함유된 유효성분 표준품 확보 및 분리기술 확립하고 

유효성분중심의 한약재 관리에 의한 한약재 품질수준향상 및 분리된 물질들의 

확인 및 순도결정을 함으로써 생리활성 및 proteomics 연구를 위한 표준화된 시료를 

제공할 수 있다. 또 동시정량법 개발로 식물의 용매추출물의 성분확인 및 함량결정을 

함으로써 추출물의 생리활성실험 결과의 분석 및 산지별 패턴 분석에 응용할 수 있다. 

한약재의 효능검색에 biochip을 활용할 경우, 수천 개의 성분이 집중된 한약재의 효능에 

관여하는 유전자들의 전체적인 경향을 분류할 수 있고 Biochip 연구 결과를 활용하여 

한약재에 포함되어 있는 성분들의 효능 및 유해성을 판단하여 국제적인 선두주자가 

될 수 있으며 Biochip을 활용하여 한약재 생리활성 물질의 효능 유전자 확인으로 

한약제제의 표준화 기준 설정 및 Biochip 활용의 활성화를 꾀할 수 있다.



세부 연구과제 요약 - 황금, 단삼의 생리활성물질 분리


연구내용


황금 20Kg을 추출하여 70% EtOH extract 약 6 Kg을 얻었다. 이중 5.9 Kg을 분획하여 CH2Cl2
extract(300g), EtOAc extract 120g, n-BuOH extract 2.2kg 과 H2O extract 1.6kg을 얻었다. 

이들 중 CH2Cl2 , EtOAc와 BuOH extract를 silica gel column을 이용하여 다음 19종의 

화합물을 분리하였다. 각각을 분광학적 수단을 사용하여 구조결정한 결과 

oroxylin A, chrysin, tanaxinⅠ, skullcapflavone Ⅱ, rivularin, wogonin, baicalein, 

2‘,5,6’- trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone, 2‘,5,7-trihydroxy-6’,8- dimethoxyflavone, 

5,7,2′,6′-tetrahydroxyflavone, 5,7,2′,5′-tetrahydroxy-8,6′-dimethoxyflavone, 

wogonin-7-O- glucuronic acid methyl ester, 6″-ethyl-wogonoside, 

viscidulinⅢ-2'-O-glucoside, wogonoside, rutin, baicalin등 flavonoid 17종과 

penolic 화합물인 guaiacol과 paeonol임을 확인하였다.

단삼은 17.45kg을 70% EtOH추출하여 70% EtOH extract 2.37kg을 만들었다. 

70% EtOH extract 분획하여 n-Hexane extract(48.8g), CH2Cl2 extract 27.89g, 

EtOAc extract 212.23g, n-BuOH extract 149.11g 과 H2O extract 1.79kg을 얻었다. 

이 중 Hexane, CH2Cl2, EtOAc 분획을 각각 크로마토그라피를 실시하여 

11종의 화합물을 분리하였다. 각 화합물들을 구조결정한 결과 

diterpenoid 화합물계열인 tanshinone ⅡΑ, tanshinone Ⅰ, cryptotanshinone, 

15, 16-dihydrotanshinone Ⅰ과 dansenspiroketallacton임을 확인하였고 

lignin 계열인 salvianolic acid B, rosmarinic acid, 9'-methyllithospermate, monomethyl 

lithospermate B, dimethyl lithospermate B와 methylsalvianolate C임을 확인하였다.


연구성과


황금으로 부터 19종의 화합물과 단삼으로부터 11종의 화합물을 분리하여 각종 분광학적 

방법으로 구조결정 한 결과 황금에서는 17종의 flavonoid와 2종의 penolic compound가 

분리되었고 단삼에서는 5종의 diterpenoid와 6종의 lignin화합물이 분리되었다. 

본 연구의 세부과제와 활성팀에게 연구에 필요한 시료를 분리하여 제공하였고 

황금시료의 경우 식약청에 10종의 화합물(유효성분 3종 (wogonin, baicalein, baicalin- 

3g 이상제공)과 그 외 7종의 화합물)을 제공 완료하였다. 

단삼시료도 차후에 유효물질 3종을 포함해 총 10종을 제공하여 대한 약전등 개정시 

기준 시험법에 반영하고 생약의 효능시험 및 biochip을 활용한 

생약의 유용성분 개발에 활용 될 것으로 사료된다.



세부 연구과제 요약 - 황금과 단삼의 생리활성성분 분석 및 동시정량법 개발


연구내용


분리된 물질의 구조 데이터를 통하여 동시정량이 가능한 기기를 선정하고 

이에 적합한 컬럼과 이동상을 결정하여 분리된 물질들의 최적의 동시분석법을 개발하고

validation을 통하여 동시정량법을 개발하였으며 시판되고 있는 한약재를 구입하여 

지표성분함량을 정량하였다. 황금의 경우 HPLC/UV 법은 wogonin, baicalein,
5,7,2',5'-tetrahydroxy-8,6'- dimethoxyflavone , baicalin, chrysin, oroxylin A의 6종 성분에 

대하여 동시분석법을 개발하였으며, 

LC-MS/MS 법은 wogonin-7-O-glucuronic acid methylester, wogonin, baicalein, 

5,7,2',5'-tetra hydroxy-8,6'-dimethoxyflavone, 5,7,2',6'-tetrahydroxyflavone, 

baicalin, chrysin의 7종 성분에 대하여 동시분석법을 개발하였고 

단삼의 경우 HPLC/UV 법과 LC-MS/MS 법 모두 rosmarinic acid, salvianolic acid B,
15,16-dihydrotanshinone Ⅰ, cryptotanshinone, tanshinone I, tanshinone IIA 의 6종 성분에 

대하여 동시분석법을 개발하였다. 또한 황금과 단삼에 함유된 생리활성물질 (6종)의 

동시정량법에 대한 validation을 다음 항목에 대해 실시함으로써 동시분석법에 대한

타당성을 입증하였다.
확립한 분석법에 의해 구입처가 서로 다른 8종의 황금 시료와 대상구입처가 다른 

16종의 단삼 검체 각각의 지표성분의 함량을 HPLC/UV 법과 LC-MS/MS 법으로 

각각 동시 분석한 결과 황금의 경우 HPLC/UV 법과 LC-MS/MS 법에서 baicalin 은 

두 가지 방법에서 오차가 최대 2 % (황금 중 baicalein 의 함량이 높은 원인으로 간주됨)까지 

되었으며 대부분의 시료는 오차가 1% 미만이었다. wogonin baicalein, 

5,7,2',5'-tetrahydroxy-8,6'- dimethoxyflavone시료는 오차가 0.5 % 미만이었다. 

단삼의 경우 HPLC/UV법과 LC-MS/MS 법에서 slavianolic aicd B는 

두 가지 방법에서 0.3 %미만이었고 나머지 성분들은 대부분 0.03 % 미만이었으며, 

몇 개 시료는 0.06 % 전후의 오차도 있었다.


연구성과


본 연구에서는 황금의 경우 HPLC/UV 법으로 6종 성분에 대하여 동시분석법을 개발하였고
LC-MS/MS법으로 7종의 성분에 대하여 동시분석법을 개발하였다. 

단삼의 경우 HPLC/UV 법과 LC-MS/MS법 모두 6종 성분에 대하여 동시분석법을 개발하였다. 

개발된 황금과 단삼의 동시분석법은 향후 대한약전 개정 시 황금과 단삼의 지표성분 분석법으로 

활용이 가능할 것으로 사료된다. 또한 확립한 분석법에 의해 구입처가 다른 8종의 황금 시료와 

대상구입처가 다른 16종의 단삼 검체 각각의 지표성분의 함량을 HPLC/UV 법과 

LC-MS/MS 법으로 각각 동시 분석하여 황금과 단삼 시료의 산지별 성분 분석결과를 얻었다. 

이 자료를 활용하여 산지별 패턴 분석 및 품질관리를 할 수 있을 것으로 간주된다.



세부 연구과제 요약 - 유전자칩을 활용한 황금, 단삼 생리활성 성분의 효능 유전자 검증


연구내용


황금은 70% EtOH 추출물과 황금으로부터 분리된 성분 8종에 대하여 항염증 효과를 검색 결과 

PGE2의 생성을 효과적으로 억제시키는 대표 성분으로 

baicalein(C1), wogonin(C2), chrysin(C3)의 3종을 효능 성분으로 선정. 

DNA microarry를 이용한 효능 유전자 검색으로 변화된 유전자에 의한 관련 Signal pathway는 

70E, C1, C2, C3에 대해서 공통적으로 inflammation 관련 유전자의 변화가 가장
크게 나타남. 그 외에 apoptosis, angiogenesis, PDGF, T cell 등과 관련된 유전자들의 변화가 나타남. 

이는 황금의 항염증 반응과 관련이 있는 것으로 사료됨. 황금 및 그 성분들의 효능 유전자로
IL-1, Ptges2, TNF-α를 비롯하여 Activin A-R I, Activin-R II A, IFN-γ, IL4-R, IL6-ST, 

IL11-R, SCS4, TGF-β 등을 제시하였다. 

단삼은 70% ethanol 추출물과 tanshinone Ⅰ, tanshinone ⅡA, cryptotanshinone, 

15,16-dihydrotanshinone I, rosmarinic acid, salvianolic acid B에 대해서 

항산화 효능을 검색한 결과 항산화 효과에 대한 효능 성분으로 tanshinone I, cryprotanshinone, 

rosmarinic acid, salvianolic acid B를 선정함. DNA microarray를 이용하여 변화된 유전자에 의한 

관련 Signal pathway 검색 결과 oxidataion, inflammation 관련 유전자들의 변화가
가장 크게 나타남. 특히 oxidative stress와 관련된 gene들의 변화가 크게 나타났으며 

관련 gene들의 분석 후, cardiovascular 질병 치료와 관련됨이 나타남. 

이러한 결과는 단삼이 심근경색 흰쥐 모델에서 SOD의 발현을 증가시키고 

지질과산화를 억제하였다는 보고 및 tanshinone 등이 심근 지질의 과산화를 억제하고 

SOD 활성을 증가시키고 PGE2의 생성을 감소시켰다는 보고와 일치하여 항산화 활성을 증명함. 

단삼 및 그 성분들의 항산화 효능 유전자로 SOD, catalase, GPx, iNOS 외에 

Acad1, Aldh2, Fasn, Fasn, Glud1, Impdh2, Hadh, Txn2, Cyp51, Gpd2 등을 제시함.



연구성과


DNA chip을 이용한 독성 유전자 검색이나 약리활성 유전자의 효능 연구는 이미 선진국에서 많이 

연구되는 방법으로 DNA chip을 이용하여 한약재의 효능검색에 활용할 경우 수천 개의 성분이 

집중된 한약재의 효능에 관여하는 유전자들의 전체적인 경향을 분류할 수 있는 장점이 있음. 

한약재의 대표적인 생리활성 물질의 효능 유전자를 biochip으로 확인하여 현재 무분별하게 

유통되고 있는 많은 한약재들에 대한 품질관리 및 유통관리가 체계적으로 이루어질 것임. 

또한 수입 한약재에 대한 품질 기준 설정에 필요한 과학적인 기준을 제시할 수 있으며 

약재 효능에 대한 증거 자료로 사용될 수 있음. 이를 바탕으로 한약재에 유통 시 

약재의 품질의 표시화 하고 등급화하여 보다 과학적인 약재 관리에 이용하여 

국민들의 한약재에 대한 불만을 제거함. 

Biochip을 이용한 기전 연구 및 다양한 효능 유전자 발굴로 신약 개발의 가능성을 높이고 더불어 

한약재에 포함되어 있는 생리활성 성분들의 효능 및 유해성 연구를 접목할 수 있을 것으로 사료됨. 

따라서 활성 성분에 대한 과학적이고 체계적인 DB를 보유하여 

세계적으로 한약재 관리의 선두주자가 될 수 있음.




세 줄 요약


1. 황금의 항염 효능 성분 : baicalein, wogonin, chrysin

2. 단삼의 항산화 효능 성분 : tanshinone I, cryptotanshinone, rosmarinic acid, salvianolic acid B

3. DNA chip을 이용한 독성 유전자 검색, 약리활성 유전자의 효능연구는 선진국에서 진행하는 방식.

   수천 개의 성분이 집중된 한약재의 효능에 관여하는 유전자의 전체적인 경향 분류 가능. 

   이를 바탕으로 한약재 관리에 적용 시 약재의 품질 표시, 등급화, 과학적 약재 관리가 가능해짐.



1편 - 한약재 성분 알아보자 (1) 대황

https://orbi.kr/00031865004


2편 - 한약재 성분 알아보자 (2) 음양곽, 천궁

https://www.orbi.kr/00031889142



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